“长江口二号”古船出水前后环境微生物变化分析

“长江口二号”古船出水前后环境微生物变化分析

 

周新光^1,2，张赛伟³，黄河^1,2，钱晓雍³，高宇^1,2，赵叶飞⁴

1. 上海博物馆，上海 200003；

2. 馆藏文物保存环境国家文物局重点科研基地（上海博物馆），上海 200231；

3. 上海市环境科学研究院，上海 200233；

4. 东华大学环境科学与工程学院，上海 201620；

 

摘要

 

 

微生物病害是出水木质古船面临的主要病害之一。其中，古船所处水/土环境中微生物的生长代谢或对古船产生直接危害，或通过改变古船所处环境进而影响文物安全，同时环境的改变也会反作用于微生物的群落结构和代谢特征。因此，环境和微生物构成相互影响的动态体系，系统、深入地研究两者之间的相互作用机制，及时发现风险甚至预测风险并采取科学有效的防治策略，是出水木质古船保护的重要方向。本研究采用环境监测结合现代分子生物学技术，对“长江口二号”古船出水前后的环境特征因子、微生物群落结构和潜在病害微生物进行分析。结果表明：“长江口二号”古船出水前后，水环境因子的变化幅度较大，水体微生物丰富度与多样性明显下降，尤其细菌丰富度大幅下降；沉积物环境因子的变化幅度比水环境因子的变化幅度小，同时微生物群落丰富度和多样性变化较小。沉积物和水环境中可参与降解木质素和纤维素的潜在病害微生物主要为芽孢杆菌（Bacillus）、曲霉菌（Aspergillus）和枝孢霉菌（Cladosporium）。此外，沉积物中存在比例较高的硫酸盐还原菌须引起关注。本研究初步建立了“长江口二号”古船环境因子-病害微生物监测评估方法体系，为后续通过科学化、系统化地积累基础数据进而采用统计分析和模型模拟手段评估甚至预测“长江口二号”古船的环境微生物风险状况奠定了基础。

 

 

 

 

0 引言

 

木质古船是重要的文化遗产，其长久保存是重要的研究课题。在打捞、转置、发掘与保存等一系列过程中，受环境与人为因素的影响，微生物的生长繁殖易造成船体的降解和腐蚀，这将对古船的保存/保护产生威胁。船体保存环境中曲霉属（Aspergillus spp．）[1]、枝孢霉属（Cladosporium spp．）[2]、芽孢杆菌属（Bacillus spp．）[2-3]、镰刀菌属（Fusarium spp．）[3-5]以及其他微生物[6-11]对船体的木质素及纤维素具有一定的降解能力，若其爆发生长会对古船长期保存产生不利影响。Liu等[4-5]研究表明镰刀菌是“南海一号”保存过程中沉船表面真菌群落最丰富的属，所分离出的茄病镰刀菌（F．solani）和尖孢镰刀菌（F．oxysporum）均能降解纤维素。Han等[12]研究发现，裸露木材和浸水木材结构内最丰富的真菌属分别是Fusarium sp．和Scedosporium sp．，是“南海一号”沉船保存过程的主要威胁。还原性铁硫复合物导致木质文物整体结构受到影响，参与硫、铁元素循环的微生物会对木质沉船产生破坏作用，如硫杆菌（Thiobacillus）、盐硫杆菌（Halobacter）和铁氧化菌（Fe oxidizing bacteria）等[13-17]。Zhu等[18]研究表明，真菌感染易出现在“南海一号”沉船富含硫和铁化合物的区域。王亚丽[19]发现明代“南澳Ⅰ号”古沉船饱水木材脱盐过程的木材含有大量Ferritrophicum和Desulfurivibrio，可参与铁、硫的氧化还原过程。

同时，微生物群落变化、代谢特征与环境因子是一个相互影响的动态平衡，要科学地评估古船面临的风险，进而采取科学有效的防治策略，需要系统性地研究环境和微生物之间的相互作用机制。近年来，通过现代生物学技术分析文物所处环境中的微生物群落分布与环境因子的相互关系，从环境的角度解决文物生物病害问题的研究已逐渐成为文物保护研究的热点之一。Xu等[20]通过16SrRNA扩增子测序的方法对湖北荆州望山桥一号楚墓的细菌多样性和群落分布进行分析，发现墓葬环境微生物的研究对探索文物降解和腐蚀机理具有重要意义，同时墓葬盗洞联通了地下墓室与外界空气环境，使原有的微生物群落分布剧烈改变，加速了有机质文物的降解，对整个墓葬产生了极大的破坏。Wu等[21]在对北石窟寺砂岩生物降解的研究中，系统分析了微生物群落与环境因子、可溶性盐之间的相互关系，认为微生物群落的结构受可溶性Cl^-、Na⁺、NO^-₃离子的影响比光照强度、含水量或温度等因素大得多，尤其是对于洞穴外的风化砂岩。Li等[22]在对金沙遗址不同劣化程度下土壤微生物的组成与多样性研究中，认为细菌和真菌群落与Na⁺、K⁺、Mg²⁺和Ca²⁺含量的差异有关，土壤微生物之间的相互作用和环境可能影响土壤劣化并加速劣化过程，威胁金沙土遗址的长期保存。

“长江口二号”古船是我国目前体量最大、保存最为完整、船载文物数量巨大的清代木质古船，具有巨大的文物考古价值。在复杂而漫长的保护历程中，“长江口二号”古船面临着出水暂存、考古发掘和保存保护等不同阶段，每个阶段微生物病害防治工作随之有所侧重，但都应是在“预防性保护”理念下基于精准的环境调控和本体防控等手段形成的整体解决方案。因此，建立科学系统的环境-微生物监测评估体系，通过深入地数据分析、发掘和模型构建，辨析古船所处环境中的主要病害微生物及影响微生物活动的主控环境因子，进而做到及时发现风险甚至预测风险并采取科学有效的保护策略显得至关重要。

2022年11月21日，“长江口二号”古船打捞出水后转移至杨浦上海船厂旧址1号船坞保存，在很短的一段时间内即面临数次较大的环境变化，从长江口海水/淡水交替的水下环境到黄浦江水的淡水浸泡环境，直至沉箱内积水排空仅积留少量日常保湿用水的水/土混合环境，水环境和沉积物中的含盐量、pH、含水率等各项指标随之骤然改变。同时在保护舱搭建完毕之前，由于各项工作需要以及露天环境中的天气变化，古船面临的环境始终处于不稳定的状态，进而对古船所处水/土环境因子和微生物群落、代谢变化产生影响。

本研究采用常规环境监测手段结合现代分子生物学技术，探索在出水前后“长江口二号”古船环境因子的变化与微生物群落特征，明确古船出水前后微生物群落变化，辨析古船面临的主要的潜在病害微生物，为建设科学、系统的环境-微生物风险评估方法与体系模型奠定了坚实的基础。

 

 

1 样品和方法

 

1.1 样品采集

“长江口二号”古船于2022年11月21日打捞出水，在约20天的时间内经历了长江口水下环境、黄浦江水浸泡环境和沉箱水排空仅积留保湿用水的水/土混合环境，根据现场实际情况，三次采取水体和/或沉积物样品用于后续分析，采样信息如下：

2022年11月21日，即“长江口二号”古船打捞出水当日，按表层、中层、下层和随机点位采取古船附近水体样品12个，水体样品信息详见表1；2022年11月22日，在沉箱停靠于横沙基地码头后，对沉箱内表层沉积物随机分布采取9个点位样品，编号依次为RS1~RS9。

2022年11月26日，此时古船处于江水浸泡状态（图1），采集沉箱内积水并按表层、中层和下层分别采集船坞内和黄浦江水样品，详见表1。

图 1　古船整体处于浸泡状态

Fig. 1　The Yangtze River Estuary No．2 shipwreck was entirely submerged

表 1　“长江口二号”古船出水前后水环境样品表

Table 1　Aqueous samples before and after salvage of the Yangtze River Estuary No．2 shipwreck

2022年12月12日，沉箱内积水排空，沉箱内覆盖棉布并开始日常保湿工作，沉箱内仅少部分积留保湿用水（图2），随机分布采集6个沉箱内表层沉积物样品，编号依次为RS10~RS15。

图 2　沉箱内覆盖棉布并开始日常保湿

Fig. 2　Covering the caisson with cotton cloth and starting daily moisturizing

1.2 样品测定

1.2.1 理化指标的测定

对沉积物样品进行含水量、pH、盐度、土壤有机质、硫化物、有机碳及脂肪酸的测定（表2），对水体样品进行电导率、氧化还原点位、含盐量、氯化物、硫酸盐、金属阳离子特征（Li⁺、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺）、氨氮、氟化物、硝态氮、温度、pH及溶解氧的测定（表3）。

表 2　沉积物样品检测指标及依据表

Table 2　Sediment sample detection indicators and bases

表 3　水体样品检测指标及依据表

Table 3　Water sample detection indicators and bases

（续表3）

1.2.2 微生物特征分析

以0.22 μm无菌滤膜过滤至少500 mL水体样品获得截留菌体的滤膜。将沉积物和水样滤膜进行DNA抽提，分别以引物338F-806R和ITS1F_ITS2R对16SrDNA和ITS1区进行PCR扩增和荧光定量检测，随后进行Illumina测序分析。Illumina测序委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测定，微生物多样性作图依托美吉云平台绘制。Illumina测序数据已上传NCBI数据库（检索号：PRJNA1091362）。

分别计算了微生物多样性指数Chao指数和Shannon指数，计算方法如下：

1）Chao指数是用Chao1算法估计样本中所含物种（如ASV）数目的指数，Chao1在生态学中常用来估计物种总数。本次分析使用计算公式如下：

(1)

式中：S_chao1为估计的物种（如ASV）数；S_obs为实际观测到的物种（如ASV）数；n₁为只含有一条序列的物种（如ASV）数（如“singletons”）；n₂为只含有两条序列的物种（如ASV）数（如“doubletons”）。

2）Shannon指数用来估算样本中微生物多样性指数之一。它与Simpson多样性指数类似，常用于反映群落alpha多样性。Shannon值越大，说明群落多样性越高。

(2)

式中：S_obs为实际观测到的物种（如ASV）数；n_i为第i个物种（如ASV）数所含的序列数；N为所有的序列数。

 

 

2 结果和讨论

 

2.1 沉积物理化和微生物特征

2.1.1 沉积物物理化学特征

“长江口二号”古船出水前（2022-11-22）、后（2022-12-12）沉积物物理化学特征如图3所示。硫化物和脂肪酸在出水前后差异较小。同时，除RS1极值点外，有机物和有机碳含量平均值在二者之间的差异仅为0.53 g/kg和0.71 g/kg。

出水前沉积物含水量平均值为40.84%，高于出水后沉积物含水量平均值（35.47%）。出水前沉积物pH平均值为8.32，而出水后沉积物呈现略高的pH平均值8.86。对于含盐量，出水前沉积物含盐量平均值（6.46 g/kg）比出水后的含盐量平均值（5.58 g/kg）更高。因此，“长江口二号”古船出水前后，所处沉积物环境短期内呈现含水量下降、碱度上升、盐度降低的趋势。

值得注意的是，“长江口二号”古船所处沉积物中的有机质含量是上海市区河道沉积物中有机质含量（约30~50 mg/kg）的数百倍，这是由于横沙岛土壤的有机质含量较高（约10 g/kg），可能由于长江口河道较之市区河道缺乏疏浚，导致沉积物中有机质含量异常高，在这种条件下，微生物活动极为活跃，是“长江口二号”古船保护、研究需要重点关注的问题。

2.1.2 沉积物微生物特征

为了反映沉积物环境群落丰富度（community richness）与群落多样性（community diversity）的变化，计算了沉积物环境微生物多样性指数chao指数和shannon指数，如图4a所示。沉积物细菌chao指数、shannon指数及真菌shannon指数波动较小，波动范围分别为3.15%、0.29%和3.84%，而真菌chao指数下降了44.97%。这表明从古船出水前后，短期内沉积物中细菌群落丰富度和多样性变化较小，同时真菌群落丰富度变化较小，但真菌的物种丰富度下降较大。

图 3　古船出水前后沉积物理化特征

Fig. 3　Physical and chemical characteristics of sediment before and after salvage of the Yangtze River Estuary No．2 shipwreck

根据高通量测序结果，绘制沉积物细菌群落结构（门水平）与真菌群落结构（属水平）如图4b和图4c所示。沉积物的细菌群落结构和真菌群落结构变化较小，但存在对古船长久保护具有威胁的潜在病害微生物。在沉积物细菌群落中，硫酸盐还原细菌占比较高，种类丰富，包括Desulfobacterota门的Desulfobulbaceae、Desulfurivibrionaceae MSBL7、Desulfatiglans、Desulfosarcinaceae、Sva0485[23-24]门及Nitrospirota门的Thermodesulfovibrionia，硫酸盐还原细菌占比之和最高可达20%，硫酸盐还原细菌参与硫酸盐的还原过程产生H₂S，对古船的金属构造造成腐蚀[25-26]，并且H₂S会对现场人员的健康产生不利影响[27-28]。在古船出水前后沉积物环境中硫酸盐还原细菌占比平均值分别为11.10%和11.37%，而硫酸盐还原细菌丰度平均值分别为1 393.43和1 573.67。这表明经过短期沉积物环境变化，硫酸盐还原菌占比变化不大，但数量呈现上升。

沉积物中可参与降解木质素和纤维素的细菌为芽孢杆菌（Bacillus）[2]，芽孢杆菌在出水前沉积物环境中的占比平均值（0.40%）低于在出水后沉积物环境中的占比平均值（1.88%），这表明短时间内沉积物环境的变化促进了芽孢杆菌生长繁殖。沉积物中可参与降解木质素和纤维素的真菌主要为曲霉菌（Aspergillus）与枝孢霉菌（Cladosporium），短期内两者占比和丰度均变化较小。

此外，沉积物中存在专性功能厌氧菌MBNT15[29]，其可参与异化铁还原过程（铁呼吸过程）[30]，也可能与金属构件的腐蚀有关。

2.2 水环境理化和微生物特征

2.2.1 水环境物理化学特征

“长江口二号”古船出水前（2022-11-21）、后（2022-11-26）的水环境物理化学特征如图5所示。由图5a和图5b可知，古船出水前后，水环境的电导率均值从16 100 μS/cm降低至26 μS/cm，水环境内SO^2-₄浓度、Cl^-浓度及金属离子（Li⁺、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺）均呈现大幅度下降，其盐度略有下降，氧化还原电位均值从150 mV升至280 mV。根据图5c和图5d可知，水体中硝态氮和F^-浓度上升，氨氮浓度变化较小，pH平均值从8.3下降至7.5，溶解氧平均值从6.72 mg/L小幅下降至5.81 mg/L。这表明古船出水前后，水环境碱性降低，溶解氧降低，离子浓度变化较大，电导率大幅下降，氧化还原电位上升。

2.2.2 水环境微生物特征

“长江口二号”古船出水前（2022-11-21）和出水后（2022-11-26）中水体微生物多样性和群落结构特征如图6所示。与古船出水前水环境相比，出水后水环境的细菌与真菌的Chao指数、Shannon指数均出现下降，其中细菌Chao指数下降幅度最大。这表明短期内水环境的变化导致水体微生物的物种丰富度与群落多样性的下降，尤其细菌群落丰富度大幅下降。

由图6b可知，水环境细菌群落结构变化明显，典型海洋菌种类和数量在出水前水环境中分布较广，而在出水后水环境均呈现下降，如Woeseia、RS62_marine_group、Oceaniserpentilla等海洋菌在出水前丰度高，而在出水后水环境中丰度极低；同时，一些非海洋菌类型的环境细菌如Flavobacterium、Alsobacter、Novosphingobium在出水前比出水后呈现更高的丰度。这表明，短期内水环境的变化导致了非典型海洋细菌丰度和多样性的增加，海洋菌群丰度和多样性的下降。

相比细菌群落结构的变化，水环境真菌群落结构的变化小（图6b和图6c），但真菌群落中存在的可参与降解木质素和纤维素的真菌包括曲霉菌（Aspergillus）和枝孢霉菌（Cladosporium），其中枝孢霉菌（Cladosporium）的群落占比较大，最高可达到6%，这表明水环境中对古船木质结构的潜在病害微生物为曲霉菌和枝孢霉菌。

图 4　埋藏与保护现场沉积物环境微生物特征

Fig. 4　Microbial characteristics of sediment before and after salvage of the Yangtze River Estuary No．2 shipwreck

图 5　古船出水前后水环境理化特征

Fig. 5　Physical and chemical characteristics of the aqueous environment before and after salvage of the Yangtze River Estuary No．2 shipwreck

图 6　“长江口二号”古船出水前后水环境微生物特征

Fig. 6　Microbial characteristics of the aqueous environment before and after salvage of the Yangtze River Estuary No．2 shipwreck

 

 

3 结论

 

1）古船出水前后，船体所处环境急剧改变，且由于各项工作的需要，环境改变将进一步复杂化，对后期微生物群落变化必然产生极大影响。本研究选择较为重要的三个时间点：长江口水下环境、黄浦江水浸泡环境和沉箱水排空仅积留保湿用水的水/土混合环境进行研究，虽然较短的时间内（20 d左右）无法建立环境因子与微生物之间的相互关系，但出水前后古船环境-微生物数据仍然是重要的基础数据，对后续的保护研究具有重要意义。

2）“长江口二号”古船出水前后，沉积物的含水量、碱度、盐度等呈现小幅变化，同时微生物群落丰富度和多样性变化较小；而水环境氧化还原电位升高，碱性降低，多种离子浓度及电导率大幅度下降，导致水体微生物丰富度与多样性的下降，尤其细菌丰富度大幅下降，这可能与海洋菌群丰度和多样性的下降有关。沉积物和水环境中可参与降解木质素和纤维素的潜在病害微生物主要为芽孢杆菌（Bacillus）、曲霉菌（Aspergillus）和枝孢霉菌（Cladosporium）。此外，沉积物中存在比例较高、种类多样的硫酸盐还原菌，短期内其丰度呈现上升趋势，需要引起特别关注。

3）随着保护舱的搭建完成及温湿度控制和相关保护措施的日趋完善，“长江口二号”古船所处环境趋于稳定，为系统化研究微生物活动与环境因子之间的相互作用机制提供了条件。后续的研究重点在于建立科学系统的环境-微生物监测评估体系，通过深入的数据分析、发掘和模型构建，辨析古船所处环境中的主要病害微生物及影响微生物活动的主控环境因子，及时发现风险甚至预测风险并采取科学有效的保护策略，为“长江口二号”木质古船的系统性保护研究与应用奠定基础。